Presentacón

A continuación esta el PowerPoint utilizado para dar la presentación oral del proyecto. 

Presentación del Proyecto Final Química Ort 2008

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Día 17: Conclusión Final

Los resultados presentados en esta monografía demuestran que se cumplieron los objetivos propuesto. La visualización de los conjugados de ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando anticuerpos específicos. Esta técnica tiene limitaciones ya que no permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo.

La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por Deyu Fang and Tom K. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Una vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo, este sistema podrá ser utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 a la ubicuitina.

Además, cabe destacar que en esta monografía se utilizaron técnicas de biología molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de diversos procesos celulares.

Día 16: Resultados de la tranfección

El microscopio de fluorescencia revelo:

Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en las células transfectadas con las distintas construcciones. Como se puede observar en la imagen de la figura 4, las células transfectadas con ambos plásmidos son fluorescentes y sorprendentemente esta fluorescencia se observa principalmente en pequeñas estructuras citoplasmáticas, visualizadas como un puntillado. La localización de estas estructuras es perinuclear. Por otro lado, las células transfectadas con los plásmidos solos no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente a la de las células cotransfectadas.

Este resultado confirma la factibilidad de la metodología, la identificación de conjugados de Jun con ubicuitina en células “in vivo” y sugiere que la ubicuitinización de Jun causa un transporte de esta proteína nuclear hacia estructuras citoplasmáticas como fue descripto por Deyu y colaboradores. 

Día 15: Transfección

El día anterior al experimento se sembraron 3000 células en placa de 24 pocillos conteniendo cubre objetos de vidrio previamente tratados con poly-L lisina. En el momento de la transfección, las células estuvieron en un 70-80 % de confluencia, fase exponencial del crecimiento de las mismas donde el ingreso del plásmido esta favorecido. Para cada pocillo se obtuvo una mezcla de transfección que constó en la preparación en forma separada de dos soluciones. En una de ellas se diluyó 1 mg de DNA (ya sea el plásmido YN-Ub o el Jun-CC)  en 200 ml de medio libre de suero y  antibiótico. La otra solución contenía 5ml de Lipofectamina^TM 2000 diluida en 200 ml de medio libre de suero y antibiótico. 

Ambas soluciones se dejaron reposar aproximadamente 15 minutos. Luego de la incubación se combina el ADN diluido con la solución de Lipofectamina^TM 2000 para la formación de los complejos y se le adicionan 600 ml del medio sin suero y sin antibiótico (volumen final 1 ml). Se mezcló suavemente y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto la monocapa de células se lavó con medio libre de suero y antibiótico y cumplido los 45 minutos se le agregó a cada pocillo los complejos. 

Las células se incubaron en estufa en su forma habitual y 5 horas más tarde se les agregó a cada pocillo 1ml de medio conteniendo 20% de suero fetal bovino, penicilina 100 U/ml y estreptom

icina 100 mg/ml (2 x el medio completo). De esta manera, al entrar en contacto con el medio presente, este se diluyó a su concentración habitual. Al día siguiente se cambia el medio de cultivo y se incuba hasta cumplidas las 24 hrs. post-transfección. Posteriormente se incubaron las células 6 hrs. a 30ºC para poder observar la complementación de fluorescencia ya que esto favorece la maduración del fluoróforo. Una vez cumplido ese tiempo las células fueron fijadas con paraformaldehido 4% en PBS durante 20 minutos. Luego se procedió a lavados exhaustivos con PBS para eliminar restos de paraformaldehido y finalmente los cubreobjetos de vidrio fueron montados en portaobjetos con medio de montaje para fluorescencia (Dako). Las células se mantienen en oscuridad. Se observo la fluorescencia de las células transfectadas con microscopio de fluorescencia (Olympus Optical CO, LTD, Japón) y se capturó la imagen de las mismas ya que este posee una cámara acoplada Olympus BX50.

Día 14: Cuantificación del ADN

La cantidad total de ADN presente en las muestras de los plásmidos purificados se determinó midiendo la absorbancia de una alícuota de dichos plásmidos a 260 nm y a 280 nm con un espectrofotómetro. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular la concentración de ADN. Una solución de 50 μg/ml proporciona una absorbancia de 1, por lo que la concentración de ADN en la muestra en μg/ml es igual a 50 x A₂₆₀ nm. El cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para calcular la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1.8 indica que hay impureza.

	260nm	280nm	260/280	Concentración
YN-Ub	0,344	0,227	1.5	0.592 μg/μl
Jun-CC	0,932	0,605	1.5	2.33 μg/μl

Día 13: Midiprep

Se realizó una midiprep para la purificación del ADN utilizando un kit comercial de Wizard Plus Midipreps DNA Purification System (Promega) que permite un método de aislamiento rápido y confiable para el ADN. Una vez obtenido el ADN, se realizó una nueva digestión enzimática para realizar una electroforesis en geles de azarosa 1% para la cuantificación utilizando un estándar גHind III.

Aqui se puede observar el procedimiento de la midiprep.

Día 12: Finalizamos el Western

Lavamos la placa con TBS Tween

Se lo dejo en "remojo" 1 hora y media, en una solución de 5% suero (750ul), 15ml TBS tween 0,1%, anticuerpo (1 en 15000 (1ul))

Volvimos a lavar la placa y finalmente la revelamos, se pudieron observar las bandas esperadas comprobando un buen trabajo.