Día 7: Electroforesis

Se evaluó la presencia de los plásmidos mediante una electroforesis en un gel de agarosa 1% (0,5gr de agarosa, 50ml de buffer TBE [2,7gr Tris, 1,3075 de ácido bórico, 1ml de EDTA 0,5 molar pH 8]) y 4μl de Bromuro de Etidio.

Se observó la presencia de ambos plásmidos en las preparaciones evaluadas.Las bandas correspondientes a los plásmidos fueron visualizadas con bromuro de etidio que emite fluorescencia cuando se ilumina con luz ultravioleta.

Día 6: Obtención del plásmido para su control II

Luego del cultivo, se observó que las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub se multiplicaron como se esperaba mientras que no hubo desarrollo de las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CFP. Con estos resultados decidimos repetir la transformación de las bacterias con el plásmido Jun-CFP.
Posteriormente, tomamos 1,5 ml de cada uno de los cultivos de las bacterias que crecieron correctamente (YN-Ub) y la centrifugamos a 10000 x g durante 2 minutos.

Preparamos una mezcla de buffer Telt conteniendo Lisozima, usamos 10 ul Lisozima y 90 ul de telt por tubo, y se la agregamos a las suspensiones de bacterias, luego agitamos utilizando un vortex para lograr una buena resuspensión.

Luego seguimos el siguiente procedimiento:

Dejamos las muestras 5 minutos a temperatura ambiente.
Hervimos las muestras durante 1 minuto.
Las dejamos en hielo por 2 minutos.
Centrifugamos 15 minutos a 10000 x g.
Recogimos el sobrenadante.
Agregamos 1 volumen equivalente de isopropanol.
Las dejamos 20 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugamos durante 20 minutos a 10000 x g y descartamos el sobrenadante.
Agregamos 10 ul de EtOH 70% (v/v).
Centrifugamos 5 minutos a 10000 x g.

En ese momento nos teníamos que ir y Karina terminó de secar las muestras al vacío y las resuspendió en 10 ul de agua estéril.

Se conservaron las muestras a -20ºC hasta la semana siguiente.

Día 5: Obtención del plásmido para su control I

Sacamos las placas y observamos los resultados.

Se observaron colonias en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub pero solo unas pocas colonias dispersas se observaron en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CFP.

Seleccionamos 2 colonias aisladas de cada placa, las colocamos en el medio de cultivo LB con el ATB correspondiente en cada caso y las dejamos incubando over-night a 37ºC.