Presentacón

A continuación esta el PowerPoint utilizado para dar la presentación oral del proyecto. 

Presentación del Proyecto Final Química Ort 2008

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Día 17: Conclusión Final

Los resultados presentados en esta monografía demuestran que se cumplieron los objetivos propuesto. La visualización de los conjugados de ubicuitina es una tarea dificultosa y hasta el momento las técnicas generalmente utilizadas para la detección de los mismos incluyen inmunoprecipitación seguida de Western Blot utilizando anticuerpos específicos. Esta técnica tiene limitaciones ya que no permite el análisis de la ubicuitinización en células in vivo.

La técnica de fluorescencia por complementación desarrollada por Deyu Fang and Tom K. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas en células in vivo. Una vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés. Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo, este sistema podrá ser utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 a la ubicuitina.

Además, cabe destacar que en esta monografía se utilizaron técnicas de biología molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de diversos procesos celulares.

Día 16: Resultados de la tranfección

El microscopio de fluorescencia revelo:

Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en las células transfectadas con las distintas construcciones. Como se puede observar en la imagen de la figura 4, las células transfectadas con ambos plásmidos son fluorescentes y sorprendentemente esta fluorescencia se observa principalmente en pequeñas estructuras citoplasmáticas, visualizadas como un puntillado. La localización de estas estructuras es perinuclear. Por otro lado, las células transfectadas con los plásmidos solos no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente a la de las células cotransfectadas.

Este resultado confirma la factibilidad de la metodología, la identificación de conjugados de Jun con ubicuitina en células “in vivo” y sugiere que la ubicuitinización de Jun causa un transporte de esta proteína nuclear hacia estructuras citoplasmáticas como fue descripto por Deyu y colaboradores. 

Día 15: Transfección

El día anterior al experimento se sembraron 3000 células en placa de 24 pocillos conteniendo cubre objetos de vidrio previamente tratados con poly-L lisina. En el momento de la transfección, las células estuvieron en un 70-80 % de confluencia, fase exponencial del crecimiento de las mismas donde el ingreso del plásmido esta favorecido. Para cada pocillo se obtuvo una mezcla de transfección que constó en la preparación en forma separada de dos soluciones. En una de ellas se diluyó 1 mg de DNA (ya sea el plásmido YN-Ub o el Jun-CC)  en 200 ml de medio libre de suero y  antibiótico. La otra solución contenía 5ml de Lipofectamina^TM 2000 diluida en 200 ml de medio libre de suero y antibiótico. 

Ambas soluciones se dejaron reposar aproximadamente 15 minutos. Luego de la incubación se combina el ADN diluido con la solución de Lipofectamina^TM 2000 para la formación de los complejos y se le adicionan 600 ml del medio sin suero y sin antibiótico (volumen final 1 ml). Se mezcló suavemente y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto la monocapa de células se lavó con medio libre de suero y antibiótico y cumplido los 45 minutos se le agregó a cada pocillo los complejos. 

Las células se incubaron en estufa en su forma habitual y 5 horas más tarde se les agregó a cada pocillo 1ml de medio conteniendo 20% de suero fetal bovino, penicilina 100 U/ml y estreptom

icina 100 mg/ml (2 x el medio completo). De esta manera, al entrar en contacto con el medio presente, este se diluyó a su concentración habitual. Al día siguiente se cambia el medio de cultivo y se incuba hasta cumplidas las 24 hrs. post-transfección. Posteriormente se incubaron las células 6 hrs. a 30ºC para poder observar la complementación de fluorescencia ya que esto favorece la maduración del fluoróforo. Una vez cumplido ese tiempo las células fueron fijadas con paraformaldehido 4% en PBS durante 20 minutos. Luego se procedió a lavados exhaustivos con PBS para eliminar restos de paraformaldehido y finalmente los cubreobjetos de vidrio fueron montados en portaobjetos con medio de montaje para fluorescencia (Dako). Las células se mantienen en oscuridad. Se observo la fluorescencia de las células transfectadas con microscopio de fluorescencia (Olympus Optical CO, LTD, Japón) y se capturó la imagen de las mismas ya que este posee una cámara acoplada Olympus BX50.

Día 14: Cuantificación del ADN

La cantidad total de ADN presente en las muestras de los plásmidos purificados se determinó midiendo la absorbancia de una alícuota de dichos plásmidos a 260 nm y a 280 nm con un espectrofotómetro. La absorbancia a 260 nm se empleó para calcular la concentración de ADN. Una solución de 50 μg/ml proporciona una absorbancia de 1, por lo que la concentración de ADN en la muestra en μg/ml es igual a 50 x A₂₆₀ nm. El cociente de absorbancias 260/280 se utiliza para calcular la pureza de la preparación. Un cociente inferior a 1.8 indica que hay impureza.

	260nm	280nm	260/280	Concentración
YN-Ub	0,344	0,227	1.5	0.592 μg/μl
Jun-CC	0,932	0,605	1.5	2.33 μg/μl

Día 13: Midiprep

Se realizó una midiprep para la purificación del ADN utilizando un kit comercial de Wizard Plus Midipreps DNA Purification System (Promega) que permite un método de aislamiento rápido y confiable para el ADN. Una vez obtenido el ADN, se realizó una nueva digestión enzimática para realizar una electroforesis en geles de azarosa 1% para la cuantificación utilizando un estándar גHind III.

Aqui se puede observar el procedimiento de la midiprep.

Día 12: Finalizamos el Western

Lavamos la placa con TBS Tween

Se lo dejo en "remojo" 1 hora y media, en una solución de 5% suero (750ul), 15ml TBS tween 0,1%, anticuerpo (1 en 15000 (1ul))

Volvimos a lavar la placa y finalmente la revelamos, se pudieron observar las bandas esperadas comprobando un buen trabajo.

Día 11: Empezamos un Western

Para conocer la técnica y saber como aplicarla en el futuro, empezamos a realizar un Western-blot. La técnica diferencia proteínas por su peso molecular, es, básicamente, una electroforesis especializada para proteínas.
Empezamos armando el gel de poliacrilamida en presencia de SDS, una diferencia con el Northren-blot es que, a diferencia del Northren que es horizontal, esta corrida se hace en vertical.

Primero necesitamos saber la concentración de nuestras muestras, para esto tomamos albúmina (una proteína muy común) y realizamos una curva de calibración, que nos permite saber la concentración en función de la absorvancia. Una vez obtenidas la concertación de la muestras, tomamos los ml necesarios para que en cada calle halla 50ug de proteínas totales.
Al finalizar la corrida, se coloca una membrana PVDF encima del gel, y se le hace pasar corriente eléctrica al igual que en la corrida, solo que esta vez las muestras, en vez de avanzar por las calles, pasan del gel a la membrana.

Una vez en la membrana, lo lavamos con TBS Tween 0,1%, luego se la bloquea, para que los anticuerpos no se unan a sitios inespecificos, y se pone el anticuerpo primario overnight.

Día 10: Conceptos

Dedicamos este dia a hacer una repaso de lo que habiamos echo, y conversar sobre lo que vamos a hacer, poniendo en claro ciertos puntos oscuros y corrigiendo errores de concepto. Se decidio que debiamos conocer la técnica de Western-Blot y, por lo tanto, realizaremos una la semana que viene.

Día 8: Sala de Cultivo

Para conocer mas la parte del proyecto en que nosotros no estamos trabajando, fuimos al laboratorio de cultivo, en el cual se trabaja en esterilidad.

Con un cultivo mas viejo, realizamos tres nuevos. Para esto primero tuvimos que "despegar" los fibroblastos del envase, ya que estos se "pegan" a las supercies. Luego, con medio de cultivo nuevo, sembramos bacterias en tres nuevos envases, esto fue despues de separar las bacterias del resto del medio, centrifugamos las muestras y tomando el pellet.

Finalmente las dejamos cultivando.

Día 7: Electroforesis

Se evaluó la presencia de los plásmidos mediante una electroforesis en un gel de agarosa 1% (0,5gr de agarosa, 50ml de buffer TBE [2,7gr Tris, 1,3075 de ácido bórico, 1ml de EDTA 0,5 molar pH 8]) y 4μl de Bromuro de Etidio.

Se observó la presencia de ambos plásmidos en las preparaciones evaluadas.Las bandas correspondientes a los plásmidos fueron visualizadas con bromuro de etidio que emite fluorescencia cuando se ilumina con luz ultravioleta.

Día 6: Obtención del plásmido para su control II

Luego del cultivo, se observó que las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub se multiplicaron como se esperaba mientras que no hubo desarrollo de las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CFP. Con estos resultados decidimos repetir la transformación de las bacterias con el plásmido Jun-CFP.
Posteriormente, tomamos 1,5 ml de cada uno de los cultivos de las bacterias que crecieron correctamente (YN-Ub) y la centrifugamos a 10000 x g durante 2 minutos.

Preparamos una mezcla de buffer Telt conteniendo Lisozima, usamos 10 ul Lisozima y 90 ul de telt por tubo, y se la agregamos a las suspensiones de bacterias, luego agitamos utilizando un vortex para lograr una buena resuspensión.

Luego seguimos el siguiente procedimiento:

Dejamos las muestras 5 minutos a temperatura ambiente.
Hervimos las muestras durante 1 minuto.
Las dejamos en hielo por 2 minutos.
Centrifugamos 15 minutos a 10000 x g.
Recogimos el sobrenadante.
Agregamos 1 volumen equivalente de isopropanol.
Las dejamos 20 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugamos durante 20 minutos a 10000 x g y descartamos el sobrenadante.
Agregamos 10 ul de EtOH 70% (v/v).
Centrifugamos 5 minutos a 10000 x g.

En ese momento nos teníamos que ir y Karina terminó de secar las muestras al vacío y las resuspendió en 10 ul de agua estéril.

Se conservaron las muestras a -20ºC hasta la semana siguiente.

Día 5: Obtención del plásmido para su control I

Sacamos las placas y observamos los resultados.

Se observaron colonias en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub pero solo unas pocas colonias dispersas se observaron en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CFP.

Seleccionamos 2 colonias aisladas de cada placa, las colocamos en el medio de cultivo LB con el ATB correspondiente en cada caso y las dejamos incubando over-night a 37ºC.

Dia 4: Transformación de Bacterias

Durante este día transformamos bacterias competentes con los distintos plásmidos, el pFLAG-CMV2 (de Sigma) que contiene la secuencia que codifica para ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent Protein (YN-Ub) y el plásmido pECFP (Clontech) que contiene la secuencia que codifica para la proteína Jun fusionada al fragmento C-terminal de la Cian Fluorescent Protein (Jun-CFP). El plásmido que codifica para YN-Ub le confiere a las bacterias transformadas resistencia a ampicilina y el que codifica para Jun-CFP les confiere resistencia a kanamicina. Hicimos 4 muestras de bacterias transformadas, 2 con cada plásmido.
Para cada transformación, a 100 ul de la suspensión de bacterias competentes se le agrega 1 ug de ADN (plásmido) en un tubo eppendorf y se siguió el siguiente protocolo:

• Incubar 30 minutos a 4ºC (en hielo).





• Incubar 1 minuto a 42ºC.





• Se llevó nuevamente la preparación 2 minutos a 4ºC (en hielo).
  
• Finalmente se agregaron 300 ul de LB, sin antibiótico, y se incubó durante 1 hora a 37 ºC con agitación.


• Por último se sembraron 50 ul de la suspensión de bacterias transformadas en placas de LB/agar en presencia de los antibióticos de selección según corresponde a cada plásmido.
  

Las placas se incubaron durante aproximadamente 12 hs a 37ºC y solo las bacterias que hallan incorporado el plásmido, y por lo tanto resistentes al antibiótico, formarán colonias.

Día 3:Práctica de Electroforosis

Empezamos preparando el medio de cultivo LB (composicion) y lo mandamos a autoclavar. Mientras esperábamos que terminase la esterilización practicamos como realizar una corrida de ADN. Para esto, primero preparamos el gel de agarosa, el cual posee, entre otras cosas, bromuro de etilio, altamente cancerigeno, por lo que es importante trabajar con guantes. Una vez hecho el gel, se podría decir que lo ponemos en un molde.




Esperamos a que se seque el gel y lo preparamos para la electroforesis, colocando además la solución con la que hicimos el gel para mantener el mismo ph. Una vez realizado esto, sembramos.

En la primera calle se encuentra el patrón, en la tercera, la primera muestra sembrada por nosotros, se puede ver que quedo un poco afuera, ya que como las calles son chicas, con falta de experiencia basta para errarle, y por eso mismo estamos practicando. Mientras dejábamos que corra, sacamos los instrumentos que habíamos dejado en la autoclave y preparamos las placas de petri. La corrida es bastante parecida a una cromatografía. Nosotros sembramos plásmidos (sin cortar), y estos tienen colorante violeta, que va corriendo "delante" de nuestras muestras.

En la imagen se puede ver muy bien el colorante de nuestras muestras, el amarillo del patrón, y apenas, el violeta y turquesa del patrón (abajo hay un link a fotos mas grandes). Nuestra muestra debería estar al nivel del turquesa, pero hasta no "revelar" el gel, no hay forma de saberlo. Para verlo hay dos formas (aunque sea, usamos dos formas), una es directamente con luz ultravioleta, y la otro con un aparato que te da la imagen en la computadora. El resultado fue el siguiente:

Por alguna razón, la primera muestra no se revelo, sin embargo la segunda si. Se puede ver que la mayor parte coincide con una parte del patrón (a la altura de el colorante turquesa), la razón por la que salio tan corrida la muestra es que no cortamos el plásmido, y por lo tanto este es redondo, creando ciertas complicaciones en la corrida.

Día 2: Inicio

Al llegar tuvimos una charla, ahora específica con nuestro grupo de trabajo. Nos contaron sobre el proyecto en el cual trabajaremos. Nos contaron que funciones cumple la proteína GAP-43 en el sistema nervisoso central y nos explicaron que para estudiar su degradación por el sistema ubicuitina/proteasoma utilizaron una línea celular de fibroblastos, NIH3T3, que no expresa esta proteína y la transfectaron en forma estable con un plásmido que tiene incorporada la secuencia de la GAP-43 y que además le confiere a estas células resistencia a un antibiótico, geneticina, para poder seleccionarlas. Luego nos explicaron la vía de degradación de proteínas mediada por el sistema ubicuitina/proteasoma y nos mostraron un gráfico que resume dicho proceso, ademas nos dieron bibliografía para que leamos sobre el tema.



Posteriormente hicimos una visita al lugar, nos mostraron las distintas instalaciones, el cuarto de cultivo y finalmente preparamos todo el material para esterilizar para comenzar con el trabajo la semana que viene.
Ah! Además vimos como Verónica, que trabaja en el otro proyecto mencionado arriba, inyectaba una proteína, la apotransferrina en cerebro de las ratas. Ella usa un equipo especial que se llama estereotáxico y permite inyectar distintas drogas o sustancias en áreas específicas del cerebro de rata estableciendo previamente las coordenadas. Nos dijeron que además de seguir con nuestro proyecto nos iban a mostrar distintas técnicas que se usan en el laboratorio en relación a los dos proyectos mencionados




Esto es lo que estaremos haciendo durante el año; el proceso es el siguiente:

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Día 1: Presentación

Llegamos al laboratorio y para nuestra sorpresa y alegría, nos recibieron con medialunas y café, y nos encontramos con el otro grupo que trabajará en el mismo lugar bajo la dirección de la Dra. Patricia Setton. Nos presentaron a ambos grupos de trabajo y nos hicieron un resumen de sus líneas de investigación. Nos hablaron del proceso de mielinización tanto en el sistema nervioso central como en el periférico, nos hablaron de las células responsables de ese proceso, el oligodendrocito y la célula de Schwann, nos hablaron de la interacción entre las neuronas, en particular sus axones y estas células.

Bienvenidos

¡Bienvenidos!

Este blog será usado por los alumnos del colegio técnico ORT, Rodrigo Cesáreo Pampin y Robby Mattes para mostrar las distintas experiencias que irán adquiriendo durante su pasantía en un laboratorio donde se llevan a cabo tareas de investigación.
Esta pasantía se desarrollará en la cátedra de Química Biológica Patológica del Departamento de Química Biológica, de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires. El grupo de investigación, con el cuál trabajaremos está liderado por la Dra. Ana M. Adamo y con ella trabajan, Karina De Moliner, Verónica Millanovich y Evangelina Aparicio, las tres estudiantes de Doctorado y Berenice Milanesio, estudiante de grado de Bioquímica.
En este laboratorio se están llevando a cabo dos proyectos de investigación:
1) Título: La Growth Associated Protein (GAP-43), su interacción con la Ubicuitina y su participación en el control del ciclo celular en células NIH3T3 transfectadas en forma estable y transiente.
Fuente de financiamiento: Universidad de Buenos Aires, Secretaría de Ciencia y Técnica, Programación Científica 2004-2007 (Subsidio B032). Directora
2) Titulo: “Efecto de la apo-transferrina en la remielinización: participación de la vía de señalización mediada por el receptor Notch en la diferenciación oligodendroglial
Fuente de financiamiento: Subsidio de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica. PICT 2004 Nº 25408.

Nuestro trabajo, durante la pasantía, consistirá en realizar trabajos de apoyo a la investigación en el marco del proyecto, y en particular trabajaremos con Karina De Moliner y con Berenice Milanesio para poner a punto un método que permitirá evaluar la conjugación de GAP-43 a Ubicuitina “in vivo” en las células en cultivo mediante un estudio de complementación de fluorescencia. Durante este trabajo haremos tranformaciones en bacterias utilizando distintos plásmidos, geles de agarosa para evaluar su presencia en las bacterias, purificación de los mismos y transfección en células eucariontes. En este blog iremos volcando todas nuestras experiencias con los resultados obtenidos.