Dia 4: Transformación de Bacterias

Durante este día transformamos bacterias competentes con los distintos plásmidos, el pFLAG-CMV2 (de Sigma) que contiene la secuencia que codifica para ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent Protein (YN-Ub) y el plásmido pECFP (Clontech) que contiene la secuencia que codifica para la proteína Jun fusionada al fragmento C-terminal de la Cian Fluorescent Protein (Jun-CFP). El plásmido que codifica para YN-Ub le confiere a las bacterias transformadas resistencia a ampicilina y el que codifica para Jun-CFP les confiere resistencia a kanamicina. Hicimos 4 muestras de bacterias transformadas, 2 con cada plásmido.
Para cada transformación, a 100 ul de la suspensión de bacterias competentes se le agrega 1 ug de ADN (plásmido) en un tubo eppendorf y se siguió el siguiente protocolo:

• Incubar 30 minutos a 4ºC (en hielo).





• Incubar 1 minuto a 42ºC.





• Se llevó nuevamente la preparación 2 minutos a 4ºC (en hielo).
  
• Finalmente se agregaron 300 ul de LB, sin antibiótico, y se incubó durante 1 hora a 37 ºC con agitación.


• Por último se sembraron 50 ul de la suspensión de bacterias transformadas en placas de LB/agar en presencia de los antibióticos de selección según corresponde a cada plásmido.
  

Las placas se incubaron durante aproximadamente 12 hs a 37ºC y solo las bacterias que hallan incorporado el plásmido, y por lo tanto resistentes al antibiótico, formarán colonias.

Día 3:Práctica de Electroforosis

Empezamos preparando el medio de cultivo LB (composicion) y lo mandamos a autoclavar. Mientras esperábamos que terminase la esterilización practicamos como realizar una corrida de ADN. Para esto, primero preparamos el gel de agarosa, el cual posee, entre otras cosas, bromuro de etilio, altamente cancerigeno, por lo que es importante trabajar con guantes. Una vez hecho el gel, se podría decir que lo ponemos en un molde.




Esperamos a que se seque el gel y lo preparamos para la electroforesis, colocando además la solución con la que hicimos el gel para mantener el mismo ph. Una vez realizado esto, sembramos.

En la primera calle se encuentra el patrón, en la tercera, la primera muestra sembrada por nosotros, se puede ver que quedo un poco afuera, ya que como las calles son chicas, con falta de experiencia basta para errarle, y por eso mismo estamos practicando. Mientras dejábamos que corra, sacamos los instrumentos que habíamos dejado en la autoclave y preparamos las placas de petri. La corrida es bastante parecida a una cromatografía. Nosotros sembramos plásmidos (sin cortar), y estos tienen colorante violeta, que va corriendo "delante" de nuestras muestras.

En la imagen se puede ver muy bien el colorante de nuestras muestras, el amarillo del patrón, y apenas, el violeta y turquesa del patrón (abajo hay un link a fotos mas grandes). Nuestra muestra debería estar al nivel del turquesa, pero hasta no "revelar" el gel, no hay forma de saberlo. Para verlo hay dos formas (aunque sea, usamos dos formas), una es directamente con luz ultravioleta, y la otro con un aparato que te da la imagen en la computadora. El resultado fue el siguiente:

Por alguna razón, la primera muestra no se revelo, sin embargo la segunda si. Se puede ver que la mayor parte coincide con una parte del patrón (a la altura de el colorante turquesa), la razón por la que salio tan corrida la muestra es que no cortamos el plásmido, y por lo tanto este es redondo, creando ciertas complicaciones en la corrida.